ELISA試劑盒的溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的適宜溫度。在樹立ELISA方法作反響動力學研究時，試驗標明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經1～2小時，產品的生成可達高峰。為加快反響，可進步反響的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中過夜，以構成較多的沉淀。但因所需時刻太長，在ELISA試劑盒中一般不予選用。
ELISA試劑盒的保溫方法除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均選用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度敏捷平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此刻可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性杰出的資料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，然后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規則的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴仍是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應嚴格約束在規則的范圍內，規范室溫溫度是指20～25℃，但具體操作時可根據說明書的要求操控溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒只需平置于操作臺上即可。應留意溫育的溫度和時刻應按規則力求。為確保這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板一起測定。
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